以shotgun技術(shù)為代表的液相色譜技術(shù)路線在對(duì)未知蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定尤其是低豐度蛋白質(zhì)鑒定方面有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),但是這種基于肽段分離的技術(shù)在分析中忽略了很多完整蛋白質(zhì)的信息(包括翻譯后修飾方面的信息)。為了彌補(bǔ)或提高此路線對(duì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)的檢測(cè)能力,Yates與其合作者們采用了一些蛋白質(zhì)酶解的新方法,即采用多種不同的酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解從而產(chǎn)生重疊的肽段。
例如,胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特定位點(diǎn)的酶解,而其他兩種酶進(jìn)行非特異性的酶解;然后利用酶解產(chǎn)生的重疊肽段統(tǒng)計(jì)分析完整蛋白質(zhì)的信息。但這種方法應(yīng)用起來(lái)非常繁瑣復(fù)雜。相比之下,雙向凝膠電泳為代表的“top-down”
技術(shù)路線在保留完整蛋白質(zhì)信息方面有著特有的優(yōu)勢(shì)。如何讓液相色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)“top-down”的路線,即用液相色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)完整蛋白質(zhì)的直接分離分析,讓它既保持其固有的測(cè)定蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)的優(yōu)勢(shì),又能夠兼具“bottom-up”技術(shù)對(duì)未知蛋白質(zhì)的鑒定尤其是規(guī)模鑒定的優(yōu)勢(shì),是色譜工作者的新課題,也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)領(lǐng)域的又一大挑戰(zhàn)。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題國(guó)內(nèi)外的一些實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了探索,典型的是采用離線的方式,即利用多維液相色譜技術(shù)直接分離完整蛋白質(zhì)。
較早采用的是以制備級(jí)等電聚焦電泳作為第一維,以反相液相色譜為第二維的聯(lián)用系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的分離。Lubman及其合作者使用Rotofor液相等電聚焦電泳儀對(duì)細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)一次性進(jìn)行等電聚焦,然后以rplc作為第二維進(jìn)行分離。該方法在自動(dòng)化和通量方面比雙向凝膠電泳技術(shù)有著明顯的優(yōu)勢(shì)。VerBerkmoes及其合作者運(yùn)用陰離子交換色譜作為第一維色譜對(duì)酵母細(xì)胞的蛋白樣品進(jìn)行分離,所得每一個(gè)餾分都被分為兩份,一份酶解后由質(zhì)譜鑒定,另一份利用電噴霧傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定,兩組結(jié)果對(duì)照起來(lái)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,在完成對(duì)未知蛋白質(zhì)鑒定的同時(shí)得到了蛋白質(zhì)的分子量等信息。
